血凝抑制实验报告

血凝抑制实验报告1

　　禽流感血凝和血凝抑制试验可用于血清中抗体水平的监测，也可用于判断未使用疫苗群体的感染状态等。该试验是目前世界卫生组织和国际动物健康组织进行全球流感监测所普遍采用的方法，而且因其具有经济、快速、可靠、操作简便、能够处理大量的样品，并能在短时间内报告禽流感抗体水平等优点，已经成为当前基层兽医实验室禽流感疫病监测和免疫抗体检测中最为常用的方法。但因该试验受人为操作影响较大，经常因操作不规范、不严谨等造成结果偏差大、重复性差等问题，现根据几年来的工作经验对该试验过程中应注意的事项做一探讨。

　　一、血凝试验操作程序

　　1、取96孔90°V形酶标板，用微量移液器在第一至第五排的1~12孔每孔加25μLPBS液。

　　2、吸取25μL标准禽流感抗原加入到第一排第1孔中充分混匀。

　　3、从第1孔吸取25μL混匀后的抗原液加到第2孔中，混匀后吸取25μL加入到第3孔中，依次进行倍比稀释至第二排最后一孔即第24孔，最后弃去25μL。第三排孔至第四排孔同上操作。

　　4、依次向第一至第五排孔的每孔中加入25μL1%的鸡红细胞悬液。

　　5、将酶标板置于微量振荡器上振荡10秒，室温（20-25℃）静置30min观察结果（如果环境温度太高，可置4℃环境下）。

　　6、结果判定：将板作45°倾斜，观察红细胞是否呈泪滴状流淌。以完全凝集（不流淌）的抗原或病毒稀释倍数为1个血凝单位（HAU）。

　　二、血凝抑制试验操作程序

　　1、根据血凝试验结果配制4HAU抗原。（即1HAU抗原除以4）

　　2、取96孔V形酶标板，用移液器在第1~12孔各加入25μLPBS。

　　3、在第1孔加入25μL被检血清，充分混匀后移出25μL加至第2孔，依次类推，倍比稀释至第12孔，弃去25μL。

　　4、按以上步骤加入阳性血清和阴性血清（各做两份），作对照孔。

　　5、在第1~12孔各加入25μL4单位抗原，置于微量振荡器上轻轻混匀，室温20-25℃下静置30min。

　　6、每孔加入25μL1%的鸡红细胞悬液。置于微量振荡器上轻轻混匀，室温（20-25℃）静置40min后观察结果，若环境温度过高，可于4℃条件下进行，红细胞将呈明显的纽扣状沉到孔底。

　　7、结果判定：只有阴性对照孔血清滴度不大于2log2，阳性对照孔误差不超过1个滴度，试验结果才有效。将酶标板作45°倾斜，以完全抑制红细胞凝集的稀释倍数判为该血清的血凝抑制滴度。当被检血清效价大于等于4log2，判为禽流感抗体阳性。

　　三、试验过程中的注意事项

　　1样品的保存及试验前处理

　　1.1采集的血液样品应及时分离血清，分装至离心管中，标记清楚，离心后吸出血清，对应编号冷藏送检，并禁止运输过程中剧烈震动。

　　1.2一般情况下，在5天内检测的样品可放置在4℃的冰箱中冷藏，否则低温冷冻保存。

　　1.3在检测前血清样品应充分混匀，混匀时采用上下缓慢颠倒几次的方法即可，切忌剧烈振荡而引起产生气泡及血清中蛋白变性。

　　1.4对出现胶冻状的血清样品，可采用反复搅动几下再离心的方法有助于缓解该状态。胶状物是含纤维蛋白和纤维蛋白原的血清，可能是由于放置时间不够造成的血清未完全析出状态。不建议直接吸取其中少量的清亮血清。

　　1.5水禽等样品为排除非特异性反应，还应相应进行灭能反应。具体操作方法：56℃水浴锅30min或加等量10%鸡红细胞，轻摇后静置30分钟，离心，收集上清液即可。

　　2器材的选择

　　2.1酶标板的选择：建议使用96孔90°V型板进行试验，通过反复试验证明：90°V型板相对于110°板及130°板来讲，具有红细胞沉降速度快，产生的凝集图像清晰、结果容易判定等优点。

　　2.2移液枪的选择及使用：

　　①单道、多道可调微量移液枪应选择合适的量程，以便精确度的提高。

　　②使用时应采用一档吸液二档排液的方法。吸取液体时，枪头要深入液下缓慢平稳吸液。加缓冲液时应加在板孔底部。倍比稀释血清时，应每孔至少反复吹吸6次，以便混合均匀，还应注意尽量避免产生泡沫引起混合不均。加抗原及红细胞时应在板内液面上方加样，以免交叉污染，影响试验结果。

　　③加样、倍比稀释时应高度集中注意力，以免漏加、重复加样等。

　　3试剂的保存及配置

　　3.1禽流感血凝抑制试验所用的抗原、阳性血清应严格按照说明书的要求进行保存和配置，试验前应提前将其恢复至室内温。抗原的保存温度为-20℃，反复冻融会降低抗原的滴度，应避免反复冻融。

　　3.2PH7.2、0.01mol/L的PBS液的制备。

　　①应尽量现用现配。

　　②每次使用前应测PH值，以免时间过长而导致PH值发生改变。

　　③由于PH试纸跨度范围偏大，PH值不易准确介定，因此采用酸度计准确测量PH值，以提高试验的精确度。

　　④全部试验均采用同一种稀释液。

　　3.31%红细胞的制备。

　　①为避免有些鸡只的红细胞有自凝现象，因此配制1%红细胞悬液时应选择采取2-3只SPF鸡或未进行过任何免疫过的成年公鸡血液。当然采血的前提条件是要按十分之一采血量比例在一次性注射器中加入抗凝剂，如肝素、枸椽酸钠、柠檬酸钠等。

　　②采血完毕后分装至2ml容量的圆底离心管中，因为通过2ml与1.5ml两种容量离心管相比较，放入1.5ml尖底离心管中的话，离心后，离心管底部红细胞不易与加入的PBS液混匀，易沉积在管底部，达不到洗脱干净的目的。

　　③经20xx~3000r/min，5~10min，弃去上液和红细胞上层的白细胞薄膜，再加入十倍以上血量的PBS液，上下缓慢颠倒（切忌用力过大使红细胞破裂），使其充分混匀，再离心弃去上清液，反复几次直至上清液清亮透明为止。

　　④在加红细胞过程中还须不断轻摇以确保红细胞均匀，使其每孔加入相同数量的红细胞。

　　⑤制备好的红细胞液如果放置后上清液变红，说明有溶血，不可再使用。

　　3.4抗原液的配制

　　①先做血凝试验测定效价，以抗原与红细胞完全凝集的孔为1HUA抗原，配制4HUA抗原应往前推算两孔，即除以4后的值。

　　②每次做试验前，必须重新检测禽流感抗原的血凝效价，以免效价发生改变而导致抗原稀释倍数不准确，从而导致试验结果不准确。

　　③为保证配制的抗原准确，还要进行抗原回滴试验。具体方法：做二排抗原回滴，在两排的第1~8孔各加25微升PBS，取4HAU抗原25微升加在两排的第1、第2孔，混匀，从第2孔倍比稀释至第4孔，弃去25微升，另一排同样。从第2至第8孔补25微升PBS，以保持75微升总量不变，另一排同样。两排的`第1至第8孔各加25微升1%红细胞，震荡10秒钟。静置30分钟观察结果。这样在第1孔为4HAU抗原，第2孔为2HAU抗原，第3孔为1HAU抗原，第4孔为1/2HAU抗原，均为75微升总量，第5至第8孔为空白对照。如果抗原回滴试验不成立，应相应调整抗原浓度直至回滴试验成立。因为如果抗原浓度过高，则所测定的抗体效价水平偏低，如果抗原浓度过低，则所测定的效价偏高。所以不调整抗原浓度至实验成立的话会对结果有很大影响。

　　4结果的判定

　　每次试验必须设阳性及阴性（空白）对照血清，判别试验是否成立。判读结果时，将酶标板倾斜45°，以孔底沉淀的红细胞流动性好，呈泪珠样流淌，边缘无凝集颗粒为凝集完全抑制。

　　5试验器具的清洗

　　每次试验完毕后，应将酶标板中液体甩净，然后用自来水反复冲净每个孔，再放入3%NaOH中4小时，清水反复冲净，再放入3%Hcl中4小时，清水反复冲净，再用蒸馏水反复冲洗几次，甩干水份，入干燥箱中干燥备用。实验用烧杯、加样槽、量筒等也应充分洗净、干燥。以免器具内有杂物、污物以及残留物从而影响试验结果。

　　四、小结

　　在进行禽流感血凝抑制试验时，应充分考虑到各方面的影响因素，提供的检测结果才会真实可靠，准确掌握禽类的免疫抗体水平，进而为科学防控禽流感提供理论依据。

血凝抑制实验报告2

　　随着养殖业的飞速发展和广大养殖户科学意识的不断提高，人们普遍认识到实验室检测技术在临床应用的重要性。下面简单介绍一下鸡新城疫微量血凝试验和血凝抑制试验的注意事项及操作方法。

　　应用：

　　用于新城疫、产蛋下降综合征和传梁性支气管炎等的母源抗体的检测、雏鸡首免日龄的确定、疫苗免疫后的免疫应答的监测、临床鸡病的鉴别诊断等。

　　注意事项：

　　一、样本要具有代表性：所采样本要能代表整体，通常采用四角加中间的随机取样法，并且确定适当的样品数量，一般1000只以下的鸡群采样率在2—5%；5000只以下1—2%；5000只以上0.5—1%。对产蛋期间的鸡群可采鸡蛋；对雏鸡或青年鸡，可采血。方法是：取青霉素小瓶，洗净后用蒸馏水冲洗、控干水分，并注意不要用消毒剂，以免影响结果。每只鸡采血量在1ml左右，不低于1ml，在室温下静置至血清自然析出。

　　二、四单位抗原的准确性：要获得准确的监测效果，先做红血球的凝集试验，即测得抗原的血凝价，尔后前移2孔作为四单位抗原的稀释度。

　　三、红血球洗脱的充分性：原则上，新城疫检测所用的红血球应来源于非疫苗免疫过的健康公鸡，但实际上却多采用免疫过疫苗的健康公鸡，有时甚至是病鸡。因此，对红血球的洗脱的次数要多、要充分，并注意转速和时间，通常采用五次变速离心法：前四次为每分钟1500转，每次5分钟，最后一次为每分钟3000转，持续7—8分钟。另外，洗红血球过程中，应注意动作要轻，玻璃仪器之间尽量减少碰撞，以免造成红血球破裂而影响结果。

　　四、结果判定的及时性：检测中，每次试验均应设抗原与生理盐水对照，加入红血球后，每隔5分钟观察一次，一旦两列对照孔图像清晰地显示出来时，应立即对样本进行结果判定，过早过晚都会影响判定结果的准确性。

　　血凝与血凝抑制试验的操作方法：

　　一、材料与仪器：新城疫抗原、1%鸡红血球、抗凝剂、生理盐水、被检血清、离心机、吸管、滴管、洗耳球、烧杯、量筒、注射器、长针头、96孔V型医用血凝板、微量移液器、微量振荡器、恒温培养箱、冰箱等。

　　二、方法：

　　1%鸡红血球的制备：

　　1.用长针刺入鸡心脏或翅下静脉，采血，采血量视用量而定，5%抗凝剂与全血的比例为1∶3—4。

　　2.洗血球：共洗4—5次，每次5—8分钟，红血球与生理盐水的比例至少为1∶2—3。离心机转速为每分钟1500—3000转，最后倾去上清。

　　3.吸红血球泥1ml加生理盐水99ml，配成1%红血球备用。

　　三、血凝试验：

　　1.血凝板上12个孔内全部加入生理盐水，每孔0.05ml，吸等量新城疫抗原于第一孔内，混匀后吸出同量于第二孔内混匀，以此类推稀释至第11孔，并弃去0.05ml，留第12孔作为生理盐水对照，然后全部孔内加入1%鸡红血球。

　　2.将血凝板置于振荡器上振荡1—2分钟，使材料充分混均，放入恒温培养箱，每5分钟观察一次，至10—15分钟取出，一般以生理盐水对照孔的图象清析地出现为准。

　　3.结果判定：红血球在反应板底部全部均匀铺开为完全凝集（++++），在血凝板底部集为一小红点为沉淀（－），如底部为一小红点，四周为凝集的红细胞，则为不完全凝集（++）。

　　4.出现完全凝集的抗原的稀释度，即为该抗原的凝集价。

　　5.四单位抗原的制备：血凝试验的结果如为28（256），则前移2孔即26（64），作为四单位抗原的稀释度。即：63ml生理盐水+1ml抗原即为四单位抗原。

　　四、血凝抑制试验：

　　1.血凝板上1—11孔全部加入0.05ml的生理盐水，于第一孔内加入等量的被检抗体，稀释至第10孔，弃去0.05ml，再加入等量的4单位新城疫抗原至第11孔，第11孔为抗原对照，12孔为生理盐水对照。在振荡器上振荡1—2分钟，放置室温约20分钟，然后加入等量的1%鸡红血球，振荡后放入恒温培养箱大约10—15分钟后进行结果判定。

　　2.结果：能完全抑制红细胞凝集的被检抗体的稀释度为该被检抗体的血凝抑制滴度。

　　注：1、HI价在23—24时免疫可产生良好的免疫应答，如在疫区可提高到24—25免疫。

　　2、24—25

　　注：#为完全抑制，++为不完全抑制，－为不抑制。