PCR自我鉴定

PCR自我鉴定

　　篇一：PCR个人经验总结

　　PCR经验总结

　　1. primers design

　　这是最重要的一步。理想的，只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的一些条件

　　a 足够长,18-24bp,以保证特异性.当然不是说越长越好,太长的引物同样会降低特异性,并且降低产量。

　　b GC% 40%-60%

　　c 5'端和中间序列要多GC,以增加稳定性

　　d 避免3'端GC rich, 最后3个BASE不要有GC,或者最后5个有3个不要是GC e. 避免3'端的互补, 否则容易造成DIMER

　　f. 避免3'端的错配

　　g. 避免内部形成二级结构

　　h. 附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5'端, 在算Tm值时不需要加上这些序列,但在检测互补 和二级结构是要加上它们

　　i. 需要使用兼并引物时, 要参考密码子使用表,注意生物的偏好性,不要在3'端使用兼并引物,并使用较高的引物浓度(1uM-3uM)

　　j. 最好学会使用一种design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online desgin et al.

　　* 引物的另一个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的 Tm低5℃。

　　设定Tm有几种公式。有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。有的是根据GC含量估算Tm。确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序使用近邻分析法。 根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的Tm值，所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。

　　为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。引物对的Tm差异如果超过5℃，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。

　　2. stability of primers

　　定制引物的标准纯度对于大多数PCR应用是足够的。引物产量受合成化学的效率及纯化方法的影响。定制引物以干粉形式运输。最好在TE重溶引物，使其最终浓度为100μM。TE比去离子水好，因为水的pH经常偏酸，会引起寡核苷的水解。引物的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的引物储存在-20℃。以大于10μM浓度溶于TE的引物在 -20℃可以稳定保存6个月，但在室温（15℃到30℃）仅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室温（15℃到30℃）最多可以保存 2个月。

　　3. optimize reactants concentration

　　a. magnesiom ions

　　Mg离子的作用主要是 dNTP-Mg 与核酸骨架相互作用，并能影响Polymerase的活性。

　　一般 的情况下 Mg的浓度在0.5-5mM之间调整。同样要记住的是在调整了dNTPs的浓度后要相应的调整Mg离子的浓度。对实时定量PCR，使用3-5mM带有荧光探针的镁离子溶液。

　　b. 其他的离子

　　NH4+ K+都会影响PCR。增加K+的浓度后, 会因为中和了核酸骨架上磷酸基团的负电荷而影响退火的温度,从而降低了PCR的 严谨性(stringency).NH4+也有相同的作用. MBI公司的TAQ酶就提供了两种BUFFER, 一种是加Mg的一种是已经混合了(NH4)2SO4的.当然, 过高的阳离子浓度(KCL>0.2M)时, DNA在94度根本不会发生变性, 当然也就无从谈起PCR了.

　　c. polymerase

　　不同公司的酶效有所不同,需要operator自己掌握适合的酶的浓度。一些高保真酶的效率要远远低于Taq polymerase,所以可能需要的酶的量也要大一些. 另外, 一般的 情况下, 变性的温度可以使用90~92度, 变性的时间也可以缩短,从而保证polymerase的活性 d. template

　　50ul PCR SYSTEM

　　human gDNA 0.1ug-1ug

　　E.Coli 10ng-100ng

　　Lamada DNA 0.5ng-5ng Plasmid DNA 0.1ng-10ng

　　4. temperature

　　a. denaturation

　　常规是94度5分钟, GC Rich的摸板是95度5分钟，除了GC Rich外, 常规的APPLICATIONS可以将这部分时间缩短到1到2分钟, 或者在CYCLE 1时给予较长的时间,而取消开始的denaturation

　　b. annealing

　　重点到了。一般情况下, 是从55度开始.根据情况配合以Mg离子浓度进行调整. 有条件的可以做gradient pcr. 退火的时间在30-60S, 时间短一些可以得到更好的效果. 因为, polymerase 在annealing temp.时也会有一些活性. 所以在A.T.的时间过长, 会极大的增加非特异性扩增的风险.另外,在对于一些困难户, 比如从gDNA里扩增大片段, 还可使用two step PCR.

　　5. touchdown PCR

　　原理很简单,但的确是一个很有用的方法。举个例子就OK, ANNEALING TEMP. 55度 94 5min—（94 30s—60 30s—72 1min）×2—（94 30s—59 30s—72 1min ）×2—（94 30s—58 30s—72 1min）×2—........—（94 30s—51 30s—72 1min）×2—（94 30s—50 30s—72 1min）×20—72 5min

　　6. hot start PCR

　　热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。尽管Taq DNA聚合酶的.最佳延伸温度在72℃，聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行PCR反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如site-directed突变、表达克隆或用于DNA工程的遗传元件的构建和操作，热启动PCR尤为有效。 限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反应液，并

　　将其置于预热的PCR仪。这种方法简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。

　　热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度。包括延缓加入Taq DNA聚合酶，在反应体系达到90度时，PAUSE，将温度保持在70度以上，手工加入polymerase，但这个方法 过于烦琐，尤其是对高通量应用，并容易造成污染。其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分，加入镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。在热循环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。有很多公司提供这样的酶。

　　ampliwax PCR Gems (Perkin Elmer)

　　Taq Bead Hot Start Polymerase (Promega)

　　Magnesium wax beads (Stratagene).

　　象手动热启动方法一样，蜡防护层法比较烦琐，易于污染，不适用于于高通量应用。还有一种方法是使用inactive DNA Polymerase. polymerase被抗体抑制失活，当变性温度超过70度时，抗体也变性了，这样polymerase又被激活了。

　　7. Booster PCR

　　我们知道1ug human genomic DNA 大约在3X105个模板分子,这样的模板分子数目可以是引物与模板很好的结合. 当模板的浓度过低,比如低于100个分子时, 引物和模板之间就很难发生反应. 引物容易自身进行反应形成二聚体.这样就有来了个 booster PCR 我一直找不到合适的词来翻译这个booster.具体是这样的.开始几个cycles保持primer的低浓度,保证primer:template的 molar ratio在107~ 108. 以确保开始扩增的准确性.然后booste Primer的浓度到正常的水平

　　8. 循环数和长度

　　确定循环数的基本原理是: 产物能够保证你进一步分析操作的最小循环数.因为过多的循环数容易造 成ERRORS和非特异性产物的积累、产物的量不够, 优化的方法有:

　　1. 增加TEMPLATE

　　2. 增加循环数

　　如何确定循环数,有一个方法.做一个PCR体系,40循环,50ul, 分别在20,25,30,35循环时从体系中取5ul,一起跑电泳分析.从而确定最佳的循环数另一个会影响PCR特异性的是PCR cycling时在两个温度间变化的速率(ramping rate).当然是越高越好.不过咱们大部分条件有限,就那么几台PCR仪,也没有多少挑选的余地

　　9. thermal cycler

　　PCR仪的因素我们经常容易忽视.长时间的使用后需要调整PCR仪,以保证其能够到达正确的温度.现在的PCR仪基本上都有自检功能(self-diagnosis).

　　10. PCR additives

　　附加物或者说enhancer实在是多种多样. 基本上包括几类, 能够增加反应退火效率的化学因子, DNA结合蛋白和一些商业试剂. 基本的原理不外是增加引物退火特异性,减少错配, 增加产物的长度和产量.在GC Rich情况中, additive可以造成配对碱基间的的不稳定,从而提高扩增的效率.而在另一种情况下,additive由于造成错配的primer-template 复合物的极大的不稳定, 而提高了扩增的忠实性.要注意的是,没有万能的enhancer全部通用,需要你根据自己的情况,最好结合gradient pcr选择最优条件.

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　　dimethyl sulfoxide(DMSO) up to 10%

　　formamide at 5%

　　trimethylammonium chloride 10-100uM

　　detergents such as Tween 20 0.1-2.5%

　　polyethylene glycol (PEG)6000 5-15%

　　glycerol 10-15%

　　single stranded DNA binding proteins

　　Gene 32 protein 1nM

　　E.coli single-stranded DNA binding protein 5uM

　　7 deaza-dGTP(for GC rich) 150uM with 50uM dGTP

　　Taq Extehder (stratagene)

　　Perfect Match PCR Enhancer(stratagene)

　　Q-solution(Qiagen)

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　　要注意的是,DMSO,GLYCEROL等会抑制polymerase的活性,所以需要scouting出最适的浓度

　　11. Template DNA preparation

　　提取DNA时的试剂会抑制PCR反应的顺利进行.因此需要对TEMPLATE DNA进行纯化.特别是SDS(<0.01%) 的情况下就能强烈抑制PCR的进行. 可以加入一些nonionic试剂,如Tween, Nonid, Trition之类的反过来抑制SDS. 还有proteinase K也要除干净, 不然会降解polymerase.

　　12. Nested PCR

　　简单点说 设计两对引物, 一对是长的, 一对是包含在长引物内的, 用长引物扩增的产物作为第二次扩增的模板,这样可以增加产物的量. 而且可以减少非特异性带和错配的情况. 增加PCR的保真性

　　高保真酶

　　高温DNA POLYMERASE是以单链DNA或RNA为模板，在dNTP和一些阳离子的存在情况下，在特定的引物指导下按3'-5'方向合成DNA.包括3种类型：

　　a.5'-3'方向的DNA合成能力,没有3'-5'方向的外切酶特性.如Taq及其突变体.这类酶的合成能力强,因为他不纠正合成中出现的突变

　　b.与a类似,有合成活性,没有3-5的外切活性.但他们能以RNA为模板,合成DNA. 如Tth DNA Polymerase

　　c.有DNA聚合活性,没有逆转录活性,但有3-5方向的外切酶活性.如pfu DNA Polymerase.可以提高忠实性。但是这些聚合酶的产量比Taq DNA聚合酶低。 酶的混合物

　　将Taq DNA聚合酶同带有3'到5'外切核酸酶活性第二种聚合酶混合在一起可以获得比单独Taq DNA聚合酶高的忠实性，并可以得到高产量及扩增长模板。

　　其他因素

　　除了酶，高浓度的dNTP或镁离子会降低忠实性。将dNTP的浓度从200μM降低到25-50μM可以增加精确度如果四种核苷的浓度不同，忠实性会受影响。进行较少的PCR循环也会有助于增加忠实性，因为增加循环数目和产物长度就会增加突变可能性。

　　篇二：医学检验自我鉴定范文

　　医学检验自我鉴定范文

　　英语水平：具有一定的英语听说读写能力

　　计算机水平：国家计算机一级

　　普通话水平：国家二级

　　学习经历：xx年8月至xx年7月 尉氏三中

　　xx年9月至xx年7月 山东聊城职业技术学院

　　实习经历：xx年8月至xx年1月在开封市第一人民医院检验科，输血科实习

　　xx年2月至今在开封市淮河医院检验科实习

　　兴趣特长：对专业理论知识掌握牢固并能熟练应用，对临检室，生化室，免疫室，细胞室等操作熟练。

　　擅长乒乓球，喜欢舞蹈，音乐

　　自我评价：极有耐心，为人诚恳，乐于助人，积极向上，有较强的团队意识和学习能力，业务知识熟练，社会适应能力强，多才多艺

　　求职意向：与检验相关职业

　　医学检验个人自我鉴定范文(三)

　　本人在校期间认真完成了本科阶段的专业知识，涉猎了许多医学书刊及文献，熟练的掌握了基础理论知识及操作技术，有很强的责任心和敬业精神，专业知识过硬，有旺盛的求知欲，广泛爱好，时间观念强;严于自律，吃苦耐劳;团队亲和力强，有较强的环境适应能力。 具有两年实习经历的我积累了很多的临床经验，熟悉和掌握了各科常见疾病的诊疗常规及治疗原则，能够正规全面系统的进行体格检查、及时完成医疗文件书写，了解常用药物的剂量及用法;多次参加危重症患者的抢救，进行了专业的“三基”培训，实习期间可独立完成检验任务，能够与带教老师达成共识，得到了医院领导及老师的肯定。可熟练完成临床检验的基本操作等。所以我希望找一份与自身知识结构相关的工作，如医学检验技术可以有更大的空间来证明自己，发展自己!

　　医学检验专业个人简历自我鉴定范文(四)

　　本人曾在校社团联合会网络信息部和检验学院学生会工作，并担任班干部;在校期间，组织策划了“广东医学院首届电子贺卡设计大赛”和“广东医学院首届电子竞技大赛”;加入了检验学院科研小组，成功申请并参与了“高效液相色谱仪检测儿童食品中的色素含量”。这些经历培养了我良好的领导、管理、协作、交际沟通和创新能力，使我能客观理智地面对问题，顾全大局，对凡事持寻求解决的态度。

　　一年的实习工作更是丰富了我的阅历，培养了我开拓创新的思维和解决问题的能力，更加系统地掌握了临床各项检测的基础理论和基础操作技术，掌握了微生物、病毒的实验检验原理和操作技术，熟悉专业仪器(如：pcr仪、酶标仪、icp仪，气质联用色谱仪，高效液相色谱仪，荧光光谱仪等)的性能和运用，有较强的综合分析能力和动手能力，也具有一定的科研能力。

　　我性格开朗、积极上进;具有良好的团队精神和人际关系，对待工作认真负责、勤恳耐劳，耐心细心，在工作中善于到激励他人的作用，同时善于并热爱与人沟通交流;敢于开拓创新，有着强烈的事业心与责任感，对人生和事业充满热情和憧憬。

　　医学检验毕业生个人简历自我鉴定范文(五)

　　我于xx年9月经过普通高考考入南方医科大学(原第一军医大学)，本人性格开朗、稳重、有活力，待人热情、真诚。工作认真负责，积极主动，能吃苦耐劳。有较强的组织能力、实际

　　动手能力和团体协作精神，能迅速的适应各种环境，并融合其中。认真的学习态度和对本专业的浓厚的兴趣，让我在各方面都表现出色。

　　从大一开始，我就特别注重在认真学习好理论课的同时，努力培养自身的综合素质，为学好专业课打下了良好的基矗从理论转为专业, 我热爱我的专业并为之投入了巨大的热情和精力，充分利用课余时间，拓宽知识视野，完善知识结构。通过阅读大量的课外相关书籍来充实自己的专业知识。在竞争日益激烈的今天，我坚信只有多层次，全方位, 高要求的发展，并熟练掌握专业知识的人才，才符合社会发展的需要, 才符合用人单位的需求，才符合自身发展的要求。

　　在校期间，我还积极参加学院. 大学生运动会等多项大型活动，培养了我的交际能力，使我懂得了如何与人和睦相处。多年的军校生活造就了我不怕苦不怕累的态度, 使我处事更务实、更有责任感。实习期间我严格遵守医院的各项制度, 积累了丰富的工作经验，和完善的专业技能. 这一切都是我不懈努力的结果，也是我所具有积极进取精神的体现。相信这将是我今后的工作的重要经验和宝贵财富。

　　深厚的专业知识，完整的知识结构，丰富的实践经验，乐观豁达的性格，严谨的军校生活, 超强的团体协作精神和亲和力，定会助我在曲折中顺利完成各项工作任务。

　　愿贵医院给我一次尝试施展自己潜能的机会，我会尽心尽责，尽我所能，让贵医院满意，让患者满意!

　　篇三：菌落PCR鉴定

　　（六）菌落PCR鉴定转化子

　　1. PCR mix的制备

　　Taq buffer（10×） 20 μL

　　(转 载于:wWw.cnboThwiN.cOM 博 威范文 网:pcr室自我鉴定)

　　dNTP（2.5 mmol/L）5 μL

　　Primer Forward（50 mmol/L） 10 μL

　　Primer Reverse（50 mmol/L） 10 μL

　　ddH2O 147 μL

　　Taq（2U/μL） 8 μL

　　total 200 μL

　　将上述溶液混匀，10 μL每管分装于200 μL PCR管中。

　　2. 常温下随机挑选转化板上的转化子，用灭菌的牙签或枪头挑取少量菌体，在LB琼脂糖平板上轻点，做一拷贝；然后将沾有菌体的牙签或枪头置于相应的装有PCR混合物的PCR管中洗涤数下（管子做好记号，将平板上点的克隆标号与管子上的对应起来，以便筛选到克隆后进行扩繁培养），盖紧管子。

　　3. 将混有菌体的PCR混合物置于PCR仪中，按常规条件扩增。PCR反应程序根据具体的引物设置，参考下列程序：

　　95℃，3 min

　　95℃，30 s 56℃，30 s 72℃，50 s 30个循环

　　72℃，10 min。

　　4. 电泳检测是否得到目的片断。如有则为阳性克隆。（取5 μL PCR反应液与1 μL上样缓冲液混合，进行1% 琼脂糖电泳，5V/cm，选择适当大小的DNA分子量标准，检查扩增产物。紫外观察PCR产物是否与插入片段大小一致？）

　　5. 将已经接种有菌落的平板置37℃培养箱培养过夜，使菌落扩增；次日挑选阳性克隆做进一步筛选或培养。步骤2也可以不点板，直接接种摇菌，尽可能安排在早上做PCR，下午就可以提质粒，得到重组载体。

　　（七）菌液PCR鉴定转化子

　　1. 取培养过夜的转化菌液20 μL，沸水浴3～5 min。

　　2. 室温12 000r/min 离心2min。取上清液作为PCR的摸板，按下列反应体系配制

　　ddH2O 13.5 μL

　　10×PCR Buffer（25mM Mg离子） 2 μL

　　dNTP（10mM each） 0.5 μL

　　Primer l（20μM） 0.5 μL

　　Primer 2（20μM） 0.5 μL

　　模板DNA2 μL

　　TaqDNA聚合酶（2.5U）1 μL

　　总体积20 μL

　　3. 加一滴液体石蜡，混匀，短暂离心。

　　4. 在PCR仪上进行PCR反应。参考下列程序：

　　95℃，3 min

　　95℃，30 s，56℃，30 s，72℃，50 s，30个循环

　　72℃，10 min。

　　5. 电泳检测是否得到目的片断。

　　1 最简单的：用枪尖或者牙签从平板或液体中沾少量菌（多了就会影响反应了，沾上点就够了），直接加入到PCR体系中反应就行了，依靠变性温度来破裂细菌释放DNA，我一直这样做大量筛选。

　　2 旁边实验室的方法：用枪尖或者牙签沾少量菌，加入到没有加酶的PCR反应体系中，沸水浴5min，冷却后加入酶，开始反应，有些不容易加热破裂的菌预先煮沸一下，可以释放更多的DNA，有利于PCR反应。

　　3 用Chelex，旁边的旁边的实验室做菌种鉴定的时候习惯用的方法：可以去除一部分杂质，降低PCR反应所受的干扰。

　　1) 5%-10%chelex 50μl(配法：5-10g chelex 加入100ml TE)+菌苔，在管壁适当研磨，震荡混匀，短暂离心

　　2) 煮沸：细菌5min，放线菌10-15min

　　3) 冷却至室温，10000-12000rpm离心5-8min，取上清扩增

　　注：chelex方法适于细菌、放线菌，chelex提前在65摄氏度水浴中预热，溶液有细小颗粒，吸取时枪尖最好先剪掉，否则不好吸。

　　这3个方法由简到繁，效果当然是依次提高了。我理解，这样的直接以细菌为模板进行PCR反应，特别是前两种，适用于大量的筛选和验证，由于加入了细菌本身的其他物质以及难免引入的培养基成分，可能会对PCR反应造成干扰，假阳性假阴性都是可能出现的，所以之后最好还要进一步验证。chelex方法可以去除一定的杂质，干扰较小，但是毕竟也不如直接以DNA为模板效果好。楼主需要根据自己的实际需要来选择合适的方法。

　　把PCR MIX加好，最好把细菌用TIP沾点就可以了。变性温度也不变，时间可长点儿，容易。

　　我也这样做过，96度变性时延长为10min左右，几乎都能扩增出来。

　　但鉴于我做的是革兰氏阴性菌，对于阳性球菌，还真不好说。